蔡金艷 張錦文 唐菲 張小瓊 徐江濤 張勇慧
1. 廣東藥學(xué)院·藥科學(xué)院，廣東廣州510006;
2. 華中科技大學(xué)同濟醫學(xué)院附屬同濟醫院，湖北武漢430030;
3. 華中科技大學(xué)同濟醫學(xué)院·藥學(xué)院，湖北武漢430030;
4. 湖北省天然藥物化學(xué)與資源評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗室，湖北武漢430030）
摘要： 目的對金線(xiàn)蓮Anoectochilus roxburghii （ Wall. ） Lindl. 中富含的主要成分kinsenoside 進(jìn)行抗癌活性研究。方法采
用磺酰羅單明Sulforhodamine B （ SRB） 法和MTT 分析法。結果對3 種敏感細胞株： 人白血病細胞株（ HL － 60 ） 、人肺癌
細胞株（ A － 549） 、人肝癌細胞株（ BEL － 7402） 篩選結果10 － 5mmol /L 的化合物kinsenoside 時(shí)抑制率均小于85%，評定
為無(wú)效。結論化合物kinsenoside 的抗癌活性不顯著(zhù)。
關(guān)鍵詞： 金線(xiàn)蓮； kinsenoside; 抗癌
DOI 標識： doi: 10. 3969 /j. issn. 1008-0805. 2010. 10. 011
中圖分類(lèi)號： R962 文獻標識碼： A 文章編號： 1008-0805（ 2010） 10-2444-02
金線(xiàn)蓮（ Herba Anoectochili） 為蘭科開(kāi)唇蘭屬植物花葉開(kāi)唇蘭Anoectochilus roxburghii（ Wall. ）Lindl. 的干燥全草，是多年生珍稀中草藥，有清涼解毒、滋陰降火、消炎止痛之功效，可用于治療肺結核咯血、糖尿病、腎炎、膀胱炎、重癥肌無(wú)力、遺精、風(fēng)濕性及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節炎、小兒驚風(fēng)、婦女白帶以及毒蛇咬傷等癥； 生于山地林下陰濕地，在我國分布于浙江、福建、臺灣、江西、西藏等省區［1］，俗稱(chēng)“金草”“神藥”“藥王”“烏人參”等?；瘜W(xué)成分方面除發(fā)現金線(xiàn)蓮中氨基酸，微量元素及糖類(lèi)的含量高外，還有黃酮類(lèi)、甾體、三萜類(lèi)等化合物分離鑒定的報道［2 ～ 4］。通過(guò)對野生金線(xiàn)蓮的化學(xué)成分研究，鑒定了兩個(gè)丁酸苷類(lèi)化合物β － D － glucopyranosyl－ （ 3R） – hydroxybutanolide （ Ⅰ，kinsenoside），methyl 4 － β － D － glucopyranosyl － butanoate（ Ⅱ） ［5］，并發(fā)現kinsenoside 含量很高。Kinsenoside 作為開(kāi)唇蘭屬多種植物含有的主要成分，其降血糖［6］、保肝護肝［7］、降血脂［8］等活性已多有研究。本實(shí)驗選取3 種敏感的腫瘤細胞株，對該化合物進(jìn)行抗腫瘤活性測試。
1 材料與試劑
1. 1 腫瘤細胞株和培養基人白血病細胞株HL － 60、人肺癌細胞株A － 549、人肝癌細胞株BEL － 7402 （ 中國科學(xué)院細胞庫） 培養在含10%胎牛血清（ 杭州四季青生物工程材料有限公司） 的RPMI 1640 培養基（ Gibco 公司） 中，培養條件為： 37℃，飽和濕度，5% CO2的培養環(huán)境。
1. 2 試劑3 － （ 4，5 － dimethylthiazol － 2 － yl）－ 2，5－ diphenyl tetrazolium bromide（ MTT） （ Sigma公司） 溶解在過(guò)濾除菌的1 × PBS （ pH 值7. 4，NaCl 0. 8%，KCl 0. 02%，Na2HPO40. 144%，KH2 PO4 0. 024% ） ，終濃度0. 5 mg /ml; SRB （ 美國Sigma 公司） 溶解在1% 的乙酸，終濃度4 mg /ml; SDS（ 北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展有限公司） 溶解在10 mmol /L 的鹽酸中，終濃度為10%; 注射用鹽酸阿霉素（ Adriamycin，ADM） 購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司。
受試藥kinsenoside 純度經(jīng)鑒定在98% 以上； 金線(xiàn)蓮藥材由福建省漳州市南靖縣和溪鎮供銷(xiāo)社提供，由中國科學(xué)院武漢植物研究所王映明教授鑒定。
2 方法
2. 1 MTT 比色法體外抗腫瘤藥物篩選取處于指數增長(cháng)期細胞種在96 孔板里（ 細胞濃度為20 000 個(gè)/ml， 100 μl /孔） ，培養24 h 使細胞貼壁，去除上清，加200 μl /孔帶藥新鮮培養基：化合物事先溶解在DMSO 或者生理鹽水里，當測試時(shí)用完全培養基稀釋成所需濃度，注意DMSO 終濃度不能超過(guò)0. 1%。每個(gè)濃度設6個(gè)復孔，并設空白對照孔（ 只加培養基） 和陰性對照，同樣設6 個(gè)復孔。培養實(shí)驗要求時(shí)間，去除上清，加100 μl /孔濃度0. 5 mg /ml 的MTT。培養4 h 后再補加100 μl /孔的10%的SDS。37℃下10 h 后取出，微震蕩5 min，放置室溫下30 min，在A(yíng)570nm 波長(cháng)下測OD 值，并計算抑制率。
抑制率（ %） =對照組OD 值－ 測試組OD 值對照組OD 值× 100%
2. 2 SRB 法體外抗腫瘤藥物篩選取處于指數增長(cháng)期細胞種在96 孔板里（ 細胞濃
度為20 000 個(gè)/ml， 100 μl /孔） ，培養24 h 使細胞貼壁，去除上清，加200 μl /孔帶藥新鮮培養基： 化合物事先溶解在DMSO 或者生理鹽水里，當測試時(shí)用完全培養基稀釋成所需濃度，注意DMSO 終濃度不能超過(guò)0. 1%。每個(gè)濃度設6 個(gè)復孔，并設空白對照孔（ 只加培養基） 和陰性對照，同樣設6 個(gè)復孔。繼續培養至試驗設計時(shí)間，終止培養，去除上清，每孔加10% TCA 200 μl，4℃條件固定l h。用二次蒸餾水
沖洗5 遍，自然晾干后每孔加入4 mg /ml SRB 溶液，室溫下染色15 min，棄上清，用1%乙酸沖洗5 遍以去除非特異性結合的染料。每孔加入100 μl 10 mmol /L Tris溶液，在A(yíng)515nm 波長(cháng)下測OD 值，并計算抑制率（ 計算方法同MTT 比色法） 。
3 結果
見(jiàn)表1 ～ 2。
4 討論
從上述的測試結果來(lái)看，化合物kinsenoside 對敏感細胞株初篩的細胞毒活性不明顯，不再進(jìn)行其他細胞株的復篩。本研究將化學(xué)與藥理方面有機結合起來(lái)，對金線(xiàn)蓮中富含［8］的主要成分kinsenoside在抗腫瘤方面的藥理活性進(jìn)行了測試，為全面評價(jià)活性化合物kinsenoside的藥理作用和藥用價(jià)值提供了科學(xué)依據。王常青等［9］初步研究表明，金線(xiàn)蓮多糖對癌細胞具有較好的殺傷作用。
參考文獻：
